يمكن للأضواء أن تكون مثيرة، ومن الواضح أنه لولا ذلك لَمَا كانت هناك مناطق لممارسة الدعارة بأضواء حمراء، ولا عشاء على ضوء الشموع. لكن بالنسبة إلى علماء البيولوجيا الجزيئية، فالشمعة الجزيئية التي تتوهَّج باللون الأخضر الفاتح هي أحد أكثر الاكتشافات إثارةً خلال العقدين الأخيرين، وقد أدَّت أيضًا إلى اكتشاف بعض التقنيات الجديدة الرائعة .
التوهُّج البيولوجي — أيْ تحويل الطاقة الأيضية إلى ضوء — ظاهرة جذَّابة وشائعة أكثر مما كنتَ تعتقد. المثير للدهشة أن التطور البيولوجي أعاد اختراعَ التوهُّج البيولوجي أكثر من ٣٠ مرة منفصلة. وفضلًا عن الحُبَاحِب واليراعات المضيئة المعروفة، توجد مجموعة كبيرة من الأسماك وقناديل البحر والبكتيريا، ومن فطر عيش الغراب أيضًا، يمكنها أن تتوهَّج في الظلام. ومع أن غالبية الدراسات الرئيسية التي أُجرِيت عن التوهُّج البيولوجي كانت تعتمد على أعضاء الضوء في الحشرات، فإن التوهُّج الأخضر الذي غالبًا ما ستراه في المعامل البيولوجية هذه الأيام ينبع من الأجهزة الجزيئية لقنديل البحر البلوري المعروف باسم «أكوريا فيكتوريا».
لماذا أصبح الجهاز المشع لهذه الكائنات الهلامية مفيدًا للغاية؟ للأمر علاقة بحقيقة أن قنديل البحر يمر بخطوتين منفصلتين بدايةً من استيعاب المحفِّز الكيميائي وصولًا إلى إنتاج الضوء الأخضر. في الخطوة الأولى، يستجيب بروتينٌ اسمه الأكورين إلى إشارةٍ (تحملها أيونات الكالسيوم) عن طريق إصدار الضوء. وبما أن المرء بإمكانه التحقُّق من اللون بتعريض البروتين المنقَّى لأيونات الكالسيوم في أنبوب الاختبار، فإننا نجد أن هذا الضوء ليس أخضر، وإنما أزرق. لكن في قنديل البحر لن ترى أبدًا الضوء الأزرق؛ لأنه سرعان ما يُمتَص فورًا بفعل بروتينٍ ثانٍ، يحوِّل الطاقة إلى الضوء الأخضر. هذا الجزيء الثاني أصبح معروفًا عالميًّا ببروتين الفلورسنت الأخضر، المعروف اختصارًا ببروتين «جي إف بي» GFP، وهو لا يحتاج إلى أي جزيئات أخرى ليشع وهجه الأخضر المميَّز؛ إذ يحفِّزه فقط الضوء الأزرق أو فوق البنفسجي، حتى لو نتج بفعل الهندسة الوراثية ولم يقترب قطُّ من قنديل البحر.
شكل ٤-١: بنية بروتين الفلورسنت الأخضر، مثلما يُظهِرها التصوير البلوري بالأشعة السينية. تمثِّل الأسهم صفائحَ بيتا المطوية التي تكوِّن البنية الخارجية البرميلية الشكل للبروتين، وتنتمي الذرات المرسومة على هيئة كرات داخل البرميل إلى البنية المسئولة عن تفاعل الضوء، أَلَا وهي حامل الضوء.
تؤدِّي هذه الخاصية المميزة التي يتسم بها بروتين الفلورسنت الأخضر إلى تطبيق علمي مهم، اقترحه لأول مرة مارتين تشالفي وزملاؤه من جامعة كولومبيا عام ١٩٩٤، وأصبح إجراءً معمليًّا شائعًا خلال بضعة أشهر. غالبًا ما يريد الباحثون نقل جين من كائن حي إلى آخَر؛ كي يبدأ الثاني في إنتاج البروتين الذي يشفِّر له هذا الجين، وسيكون من المفيد أن توجد طريقة بسيطة للتأكُّد من حدوث هذا الانتقال. عن طريق دمج الجين المُنتِج لبروتين الفلورسنت الأخضر مع الجين محل الاهتمام، في أثناء محاولة الانتقال الجيني، ووضع الخلايا المنقولة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (المتاح في كلِّ معملٍ من معامل البيولوجيا الجزيئية)؛ يمكن التحقق فورًا من الأمر. فإذا أصدرَتِ الخلايا ضوءًا أخضر، فقد تمَّ النقل بنجاح، هذا هو الأمر بكل بساطة. كانت هناك تحليلات مشِعَّة أخرى من قبلُ، ولكنها كانت جميعًا تتطلَّب موادَّ كيميائية إضافية، يجب نقلها إلى الخلية عبر غشائها الخلوي. وإذا رفضَتِ الخلايا الركيزةَ المطلوبة لأي سبب، فسيؤدي هذا إلى نتيجة سلبية زائفة.
بالتالي، اعتُبِر بروتين الفلورسنت الأخضر مؤشرًا جينيًّا ذا إمكانيات فريدة، وخلال عام من ظهور أول بحث عن تطبيقاته العلمية، كان الجين المُنتِج له متاحًا تجاريًّا بصفته إحدى أدوات البيولوجيا الجزيئية. كما استمتع علماء الفيزياء الحيوية أيضًا باستخدام هذا البروتين، وحاولوا أيضًا زيادة فائدته بجعله يلمع بألوان مختلفة، بل وأمكنهم حتى أن يجعلوه يومض بأسلوب إيقاعي، مثلما سنرى فيما يلي.
واجهت الأبحاثُ الرئيسية التي أُجرِيت عن بنية بروتين الفلورسنت الأخضر وآليته صعوبةً في مواكبة سرعة التقدُّم في مجال البيولوجيا الجزيئية. فلم يُكشَف عن البنية الجزيئية لهذا البروتين إلا في عام ١٩٩٦، وقد وُجِد أنها تتمتع بتركيب بروتيني جديد وغريب؛ فالغلاف الخارجي للبروتين عبارة عن برميل متناسق تمامًا وضخم للغاية مكوَّن من ١١ جديلة من صفائح بيتا المطوية، وأطراف البرميل مغطَّاة بأغطية مكوَّنة من مقاطع لولبية قصيرة، وداخل تجويف البرميل يوجد لولب أطول كثيرًا يتوافق محوره مع محور البرميل، وفي وسط هذا اللولب، الذي يشبه الخيط في وسط مصباح الضوء، نجد الجزء المشع من الجزيء؛ حامل الضوء، وهو يتكون نتيجة تفاعل كيميائي غير عادي يتم بين بقايا الحمض الأميني المجاورة داخل السلسلة البروتينية، عندما يتعرَّض البروتين للطي لأول مرة.
وتُعتبَر معرفة البنية الثلاثية الأبعاد لهذا البروتين ذات أهمية خاصة؛ لأنه يُعتقَد أنها تحفِّز نفس العملية غير العادية التي يتكوَّن بفضلها حاملُ الضوء. وبما أن تكوين حامل الضوء قد تمَّ بسلاسةٍ في كل كائن حي مضيف خضَعَ للتجربة من قبلُ، فقد شكَّ الباحثون في أن التفاعل ذاتيُّ التحفيز؛ أي إنه تفاعُلٌ يحفِّزه نفس الجزيء بدلًا من إنزيم آخَر غير معروف حتى الآن.
ومع هذا، لم يظهر دليل يؤكِّد صحة هذه الفرضية إلا في عام ١٩٩٧ على يد براين ريد وجريج فلين من جامعة أوريجون؛ فقد أنتَجَا البروتين في صورة سلاسل متعددة الببتيدات غير مطوية بعدُ ومرتبطة بما يُطلَق عليه اسم الأجسام المشتملة في «الإشريكية القولونية». بعد تنقية الأجسام المشتملة، استطاعوا ملاحظة جزيئات بروتين الفلورسنت الأخضر التي لم تتعرض للطي قطُّ، ناهيك عن التنشيط، وهي تُطوَى وتُنفِّذ التعديلات الكيميائية التي تؤدِّي إلى تكوين حامل الضوء، وهي عملية تستمر عدة ساعات.
تتيح لنا هذه البنية المعروفة أيضًا فهْمَ أو التنبؤ بالكيفية التي تؤثِّر بها الطفرات — أيْ تبادُل أحماض أمينية بعينها في التسلسل النووي — على توهُّج البروتين. ومع أن الضوء الأخضر الناتج يكون بالضرورة أحادي اللون (أي إن جميع الفوتونات لها تقريبًا نفس الطول الموجي)، فإن امتصاص الطاقة يمكن أن يحدث في نطاقين مختلفين للطَّيْف. يجيد البروتين الطبيعي المأخوذ من قنديل البحر امتصاصَ الضوء بدايةً من البنفسجي وصولًا إلى فوق البنفسجي (حوالي ٣٩٦ نانومترًا)، ولكنه يستطيع أيضًا استخدام الضوء الأخضر المائل إلى الزُّرقة بأطوال موجية تبلغ حوالي ٤٧٦ نانومترًا.
توصَّلَ الباحثون إلى أن النطاق الأول يتضمَّن الحالةَ المحايدة كهربائيًّا لحامل الضوء، في حين أن النطاق الثاني يتطلَّب شحنةً سالبة في هذا الجزء من الجزيء. وعن طريق إحداث تغييرات معقَّدة في تلك المناطق من البروتين المعروفة بقربها إلى حامل الضوء، يستطيع الباحثون التأثيرَ على حالة شحنته، وبالتالي إنتاج صور من بروتين الفلورسنت الأخضر بخواصَّ بصرية شديدة التخصيص. على سبيل المثال، تقتضي الدواعي العملية امتصاصًا قويًّا بطول موجي يبلغ ٤٨٠ نانومترًا؛ نظرًا لوجود أشعة ليزر تتميَّز بهذا الطول الموجي تحديدًا، ويمكن استخدامها لإنارة جزيئات البروتين بدقة متناهية من حيث الزمان والمكان معًا.
أدَّت اثنتان من هذه الصور أيضًا إلى اكتشاف الومضات في بروتين الفلورسنت الأخضر، وذلك في عام ١٩٩٧ على يد فريقٍ بقيادة دبليو إي مورنر من جامعة كاليفورنيا في سان دييجو. فلكي يراقِب العلماء جزيئاتٍ بعينها من بروتين الفلورسنت الأخضر على نحو مستقل، وضعوا جزيئات البروتين في هُلام مسامي، لكي تعجز عن الحركة بينما يظل بإمكان كلٍّ من الضوء والمواد الكيميائية الوصول إليها، وعرَّضوا الجزيئات الحبيسة لضوءٍ ذي طول موجي مناسب، وصوَّروا التوهُّج بواسطة ميكروسكوب. يمكن تسجيل الانبعاث الضوئي لجزيئات بعينها على نحو منفصل، شريطةَ أن تكون الجزيئات منفصلةً بمسافة أطول من درجة وضوح الميكروسكوب.
بهذه الطريقة، استطاع مورنر وزملاؤه التوصُّل إلى أن كلَّ جزيء يتلألأ لبضع ثوانٍ، ثم يخمد لبضع ثوانٍ، ثم يبدأ في السطوع مرة ثانية. دام هذا «الوميض» لدقيقتين، وانتهى عندما انبعث من الجزيئات حوالي مليون فوتون، وعندئذٍ «انسحبت» وبقيت غير نَشِطة على نحو دائم. ومع هذا، فحتى هذه الحالة «الانسحابية» يمكن إعادة تنشيطها بتعريضها لضوء ذي طول موجي أقصر (طاقة أعلى) من ذلك المُستخدَم في التجربة الأصلية.
من الواضح أن البروتين يمكن أن يظهر في ثلاث حالات: الحالة النَّشِطة، والحالة الدائمة الظلام، والحالة المتقطعة الظلام. ومع أن علماء الفيزياء واثقون في أنهم يستطيعون تفسير الحالتين الأوليين، فإن الحالة المظلمة بين النبضات الضوئية هي ما حيَّرتهم. لا تزال النظريات الحالية افتراضية بعض الشيء، ولن أخوض في مزيد من التفاصيل بشأنها.
بصرف النظر عن التحدي الفكري والإبداعي، تتمتع هذه التجربة أيضًا بأهمية عملية؛ فقد يكون هذا أولَّ نظام بصري جزيئي يمكن تشغيله في درجة حرارة الغرفة بين حالتين مختلفتين يمكن استخراجهما من جزيئات بعينها. وبالتالي، فالجزيء الذي يستجيب لضوء قصير بالوميض، سيشفِّر للرقم ١، في حين أن الجزيء الذي يمر بالحالة المظلمة سيشفِّر للرقم صفر في النظام الثنائي.
ومع أن تشغيلًا مماثلًا يمكن أن يتم في بروتين رودوبسين الجرثومي، فإنه في هذه الحالة سيتطلب استخراج المعلومات المخزنة في الجزيئات قياسًا للامتصاص، ونظرًا للميزة التي يتمتَّع بها بروتين الفلورسنت الأخضر من حيث تلألؤه وسهولة رصده على مستوى الجزيء الواحد، فمن المحتمَل ظهور تطبيقات في العديد من المجالات للأجهزة الإلكترونية البصرية في المستقبل، وصولًا إلى الكمبيوتر المعتمِد على البروتين المراوغ.
لكن إذا عدنا إلى واقع الوقت الحاضر، فسنجد أن تطبيقات بروتين الفلورسنت الأخضر وصوره المتنوعة قد أصبحت إجراءً شائعًا في العديد من المعامل. كما أن الميكروبات الوحيدة الخلية ليست هي الوحيدة التي تلمع في الظلام لتكشف عن وجود جين منقول؛ ففي بعض الأماكن سيصدر ضوء عن نباتات وحيوانات بأكملها، وفي أماكن أخرى سيصدر ضوء عن أجزاء معينة منها، مثل الأورام الخبيثة. دمج كارل جيه أوباركا وزملاؤه بمعهد أبحاث المحاصيل الاسكتلندي في دَندي فيروساتِ النباتات بواسِم بروتين الفلورسنت الأخضر لكي يدرسوا كيفية انتشار الفيروس عبر النباتات المصابة، والعوامل التي قد تؤثِّر في نموه. كما استخدَمَ علماءُ وظائف النبات في اليابان بروتينَ الفلورسنت الأخضر كي يدرسوا تفاعُلَ الصدمة الحرارية في نبات الأرز.
يلمع بروتين الفلورسنت الأخضر في الحيوانات بنفس درجة لمعانه في النباتات، وقد احتوت دراسات رائدة على التعبير الجيني لهذا البروتين في ذبابة الفاكهة (١٩٩٤) وفي السمك المخطط (١٩٩٥). وباستخدام نوع من بروتين الفلورسنت الأخضر ذي كثافة لمعان متزايدة، استطاع ماسارو أوكابي وزملاؤه من جامعة أوساكا باليابان لأول مرة استيلادَ فئران تلمع تمامًا باللون الأخضر تحت مصباحٍ للأشعة فوق البنفسجية. نقل الباحثون الجين إلى البويضات المُخصَّبة، فاستطاع بالفعل الانتقالَ إلى جميع خلايا الجسم البالغة؛ وعلاوة على ذلك، انتقل الجين أيضًا إلى جيل جديد من الفئران اللامعة باللون الأخضر.
لا تهدف مثل هذه الدراسات بالطبع إلى تناوُلِ المشكلات التي قد تقابلها عندما تعجز عن تحديد مكان فأر التجارب في الظلام، بل إنها تَعِد، بصفة أساسية، بتقديم أفكار جديدة لتحسين الأجِنَّة الثديية، إلى جانب أدواتٍ تشخيصية جديدة في التطبيقات الطبية. يمكن استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر لتعقُّب انتشار النمو الثانوي للأورام السرطانية. بصفة عامة، كلما لُوحِظت خلايا من أصل مختلف معًا، يقدِّم الوَسْم بالفلورسنت وسيلةً سهلة لتمييزها، كما أن طُرُقَ العلاج الجيني في المستقبل ستستفيد بالتأكيد من خيار التحكم في الجين العلاجي واستهدافه باستخدام واسِم بروتين الفلورسنت الأخضر. وفي تجربة رائدة، ربما يمكن تقديمُ هذا البروتين إلى مستنبت خلوي مشتقٍّ من خلايا الميلانوما في الإنسان، والحفاظُ على استقراره فيها.
سيُصمَّم المزيد والمزيد من الأدوات بواسطة بروتين الفلورسنت الأخضر، ومن أجله. في أحد الأمثلة الحديثة، جمع أتسوشي مياواكي وزملاؤه من جامعة كاليفورنيا في سان دييجو صورتين ملوَّنتين مختلفتين من هذا البروتين في بنية واحدة، فأحاطا وحدة ارتباطية من الكالسيوم مصنوعة من بروتين كالمودولين والببتيد «إم ١٣» M13. بمجرد ارتباط الكالمودولين بأيون الكالسيوم، تتغيَّر هندسة البنية بحيث تستطيع الصورة التي تمتصُّ وتشع بأطوال موجية أقصر تمريرَ الطاقة إلى شطر بروتين الفلورسنت الأخضر الثاني، الذي سيشع عندئذٍ الضوءَ بطول موجي مميَّز. وبناءً على كفاءة الارتباط التي تتسم بها صورة الكالمودولين المستخدمة، تستطيع هذه الوسيلة قياسَ تركيزات الكالسيوم المتراوحة ما بين جزءٍ من المائة وجزء من ١٠ مليارات من المول للِّتر الواحد، بدرجة وضوح فراغية تتيح للباحثين مقارنةَ التركيزات بين الأقسام المختلفة لخلية واحدة.
• الفيزياء الحيوية، والطب، وعلم الأحياء التنموي، وعلم الأحياء الجزيئي … فيما يبدو لا يوجد جانب في مجال علوم الحياة الواسع لم تُضِئْه الشعلةُ الخضراء بعدُ. يعمل بروتين الفلورسنت الأخضر كركيزة نموذجية، ومِسبارٍ لقياس المؤشرات الفيزيائية الحيوية داخل الخلية، ومتعقِّبٍ فلورسنتيٍّ لمتابعة مسارات النقل في الخلايا أو الكائنات الحية. ومع أن ثمة جزيئات أخرى قد حظيَتْ مثله بأهمية رائعة، فإن أحدها لم يطل كثيرًا من الجوانب المختلفة أو ظهرت له تطبيقات عملية في العديد من المجالات. يبدو أن الضوء الأخضر متفوِّق في هذه المسألة واحتمالات تطبيقه لا تزال واسعة.
أحدث التطورات
بدايةً من عام ٢٠٠٧، لمع بروتين الفلورسنت الأخضر والعديد من المنتجات المشتقة منه بألوان عديدة في أماكن كثيرة حول العالم. وقد أظهرت عملية بحثٍ سريعةٍ على موقع جوجل ١٧٤ مليون نتيجة بحث عنه. وثمة قليلون مرشَّحون بقوةٍ لنيل جوائز نوبل في المستقبل في هذا السياق.